Херрингтон С., Макги Дж. «Молекулярная клиническая диагностика. Методы» 1999 год
Автор: Херрингтон С., Макги Дж.
Год: 1999
В книге авторитетного коллектива авторов из Англии, Голландии, Испании, США и других стран подробно описаны новейшие молекулярно-диагностические методы, которые находят все более широкое применение в клинических лабораториях. Среди них: иммуноцитохимическое генотипирование клеток и его использование для диагностики раковых заболеваний; гибридизация in situ, позволяющая обнаруживать специфические нуклеиновые кислоты в интактных клетках, срезах тканей и мазках; полимеразная цепная реакция и ее применение для выявления минимальных количеств вирусной ДНК в тканях и цитологических препаратах. Описаны также методы определения отцовства и идентификации личности.
Для иммунологов, вирусологов, онкологов, молекулярных биологов.
Предисловие
Список авторов
Список сокращений
Глава 1. Молекулярные методы, использующиеся в клинической диагностике
1. Введение
2. Молекулярная клиническая диагностика
2.1. Фенотипирование
2.2. Генотипирование
2.3. Анализ экстрактов тканей
2.4. Перспективы
Литература
Глава 2. Иммуноцитохимия: световая микроскопия
1. Введение
2. Выбор иммуноцитохимического метода
3. Изготовление препаратов
3.1. Тканевые срезы
3.2. Мазки
4. Первые антитела
4.1. Проверка антител
4.2. Хранение антител и работа с ними
5 Система иммуномечения
5.1. Выбор системы иммуномечения
5 2. Выбор метки
5.3. Выбор метода
6 Контроли
6.1. Контроль реагентов
6.2. Контроль процедур
7. За лабораторным столом
7.1. Оборудование и реактивы
7.2. Подготовка к окрашиванию
7.3. Реагенты
7.4. Работа с препаратами
7.5. Специальные красители и красители для контрастирования
7.6. Проблема нехватки материала
7.7. Совмещение иммуноцитохимического анализа с гиб- ' ридизацией in situ
7.8. Автоматизация
8. Улучшение качества иммуноокрашивания
8.1. Время инкубации
8.2. Температура инкубации
8.3. Титр
8.4. Встряхивание
8.5. Уменьшение неспецифического окрашивания
8.6. Тканевые пигменты
8.7. Детергенты
8.8. Срезы
8.9. Повторное наслаивание
8.10. Комбинация методов
9. Двойное и тройное окрашивание
9.1. Последовательное окрашивание
9.2. Одновременное окрашивание
10. Некоторые проблемы и способы их решения
10.1. Другие замечания
Литература
Глава 3. Иммуноцитохимия: электронная микроскопия
1. Введение
2. Практические аспекты
2.1. Приготовление образцов
2.2. Фиксация
2.3. Смолы
2.4. Приготовление срезов
2.5. Иммуномечение
2.6. Контроли
2.7. Фоновое мечение
2.8. Неожиданный отрицательный результат
2.9. Количественная обработка данных
Литература
Глава 4. Методика выявления ДНК/РНК с помощью гибридизации in situ
1. Введение
2. Выбор методики
2.1. Нуклеиновая кислота-мишень
2.2. Чувствительность
2.3. Специфичность
2.4. Лабораторные аспекты
3. Принципы гибридизации in situ
3.1. Выбор молекулы-свидетеля
3.2. Характер зонда и его мечение
3.3. Фиксация препаратов и подготовка предметных стекол
3.4. Предварительная обработка срезов
3.5. Денатурация и гибридизация
3.6. Отмывание образцов после гибридизации и ингиби-рование эндогенной ферментативной активности
3.7. Детекция гибридизовавшегося зонда
4. Контроли
4.1. Положительные контроли
4.2. Отрицательные контроли
5. Возможные причины неудач
5.1. Растрескивание срезов или нарушение морфологии тканей
5.2. Слабый сигнал или полное его отсутствие
5.3. Невоспроизводимость результатов
5.4. Высокий фон
6. За лабораторным столом
6.1. Оборудование
6.2. Реактивы
6.3. Автоматизация
7. Комбинирование методов
7.1 Гибридизация in situ и гистологическое окрашивание
7.2. Гибридизация in situ и иммуноцитохимия
7.3. Многократная гибридизация in situ
8. Использование метода гибридизации in situ для диагностики заболеваний
Литература
Глава 5. Обнаружение вирусных генов методом гибридизации in situ
1. Введение
2. Принципы метода
2.1. Подготовка предметных стекол
2.2. Изготовление образцов
2.3. Обработка срезов до гибридизации
2.4. Зонды
2.5. Денатурация
2.6. Условия гибридизации
2.7. Промывание препаратов после гибридизации
2.8. Системы детекции
2.9. Окрашивание
3. Контроль специфичности
4. Стандартные протоколы
4.1. Гибридизация ДНК, содержащейся в цитологических препаратах, с 358-ДНК-зондами
4.2. Гибридизация ДНК, содержащейся в гистологических срезах, с 358-ДНК-зондами
4.3. Гибридизация РНК, содержащейся в тканевых срезах, с 358-РНК-зондами
4.4. Гибридизация с биотинилированными ДНК-зондами
5. Интерпретация результатов
6. Количественная оценка
7. Чувствительность метода ГИС
8. Проблемы, возникающие при гибридизации in situ
9. Применение гибридизации in situ в клинической диагностике
9.1. Вирус папилломы человека
9.2. Цитомегаловирус
9.3. Вирус простого герпеса
9.4. Вирус Эпштейна—Барр
9.5. Вирус гепатита В
9.6. Вирус иммунодефицита человека
9.7. Другие вирусы
Литература
Глава б. Выявление генетических нарушений в опухолевых клетках
1. Введение
2. Методологические аспекты
2.1. ДНК-зонды
2.2. Мечение зондов и ихдетекция
2.3. Гибридизация in situ с несколькими мишенями
3. Методические аспекты гибридизации in situ
3.1. Фиксация и обработка препаратов
3.2. Предварительная обработка препаратов солидных опухолей
3.3. Определение числа гибридизационных сигналов и интерпретация результатов
4. Практическое применение
4.1. Интерфазная цитогенетика и кариотипирование
4.2. Интерфазная цитогенетика и проточная цитометрия
4.3. Определение гетерогенности опухолей
5 Заключение
Литература
Глава 7. Локализация клеточных мНРК в клинических препаратах с помощью изотопно меченных РНК-зондов
1 Введение
2. Получение зондов
2.1. Субклонирование ДНК-матриц в векторе для синтеза РНК
2.2. Линеаризация вектора
2.3. Транскрипция in vitro и мечение зондов
2.4. Выбор радиоактивной метки
2.5. Размер зонда
3. Подготовка тканей
3.1. Работа с тканями
3.2. Фиксация
3.3. Обработка предметных стекол
3.4. Получение срезов
4. Предварительная обработка клеток и тканей
5. Гибридизация
6. Отмывание препаратов после гибридизации
7. Радиоавтография
8. Одновременное проведение гибридизации in situ и имму-ноцитохимического анализа
9. Контроли и специфичность гибридизации in situ
9.1. Ткань
9.2. Зонд
9.3. Специфичность гибридизации
9.4. Гистологический контроль
10. Количественные определения
11. Интерпретация данных
12. Требования к безопасности экспериментов по гибридизации in situ с применением радиоактивных изотопов
13. Некоторые примеры ГИС с мРНК в клинических препаратах с использованием изотопно меченных кРНК-зондов
13.1. Биоптаты, полученные при хирургических операциях
13.2. Эндоскопические биоптаты
13.3. Цитологические препараты
13.4. Аутопсийный материал
13.5. Культуры тканей
Литература
Глава 8. Выявление мНРК в клинических препаратах с помощью неизотопной гибридизации in situ
1. Введение
1.1. Клеточные линии как модельные системы
1.2. Контроли
2. Получение образцов тканей и подготовка их к гибридизации
2.1. Предупреждение загрязнения РНКазами
2.2. Образцы
2.3. Фиксация
2.4. Демаскирование нуклеиновых кислот
3. Гибридизация in situ
3.1. Зонды
3.2. Предгибридизация
3.3. Денатурация
3.4. Гибридизация
3.5. Отмывание после гибридизации
3.6. Детекция
4. Транскрипция in situ
5. Заключение
Литератур
Глава 9. Применение гибридизации in situ для диагностики цитопатологий
1. Введение I
2. Получение материала и подготовка препаратов
3. Фиксация препаратов и демаскирование нуклеиновых кислот
3.1. Фиксация
3.2. Демаскирование нуклеиновых кислот
4. Денатурация и гибридизация
5. Отмывание препаратов после гибридизации и детекция
5.1. Отмывание
5.2. Детекция гибридизовавшегося зонда
6. Контроли
6.1. Параллельный контроль
6.2. Внутренний контроль
7. Интерпретация результатов
7.1. Локализация сигнала
7.2. Чувствительность метода
7.3. Специфичность
8. Практическое применение гибридизации in situ
Литература
Глава 10. Районы ядрышкового организатора и фибриллярные центры
1. Введение
2. Методы выявления ЯОР/фибриллярных центров
2.1. Применение
2.2. Окрашивание серебром ЯОР метафазных хромосом
2.3. Окрашивание серебром интерфазных фибриллярных центров
3. Более редкие методы выявления ЯОР
3.1. Ультраструктурный метод
3.2. Метод, основанный на связывании ионов висмута
3.3. Гибридизация in situ
3.4. Последовательное применение иммуногистоцитохи-мических методов и окрашивания Ag
3.5. Иммуноцитохимическое выявление белков, ассоциированных с ЯОР
4. Количественное определение AgHOP на интерфазных хромосомах
4.1. Техника анализа изображений
4.2. Размер AgHOP
5. Применение методов, основанных на анализе интерфазных AgHOP, в гистопатологии
Литература
Глава 11. Применение проточной цитометрии в молекулярной клинической диагностике
1. Введение
1.1. Общие принципы проточной цитометрии
1.2. Измерение содержания ДНК
2 Приготовление клеточных суспензий
2.1. Дезагрегация свежих солидных опухолей
2.2. Суспендирование архивных препаратов, залитых в парафин
3. Окрашивание ДНК
3.1. Использование другой ДНК в каче